Theta Protein Refolding Kit

组分

1.       产品概述

·        用途：用于从大肠杆菌表达的包涵体中复性重组蛋白，通过筛选15种不同缓冲液条件，快速确定最佳复性参数。

·        优势：采用部分因子实验设计（fractional factorial matrix），简化条件优化流程，节省时间和资源。

·        适用对象：需从包涵体回收活性蛋白的研究人员，适用于实验室规模到中试生产。

2.       原理

·        蛋白质复性：包涵体中蛋白质因折叠中间体聚集而失活，复性需克服聚集并促进正确折叠。

·       关键影响因素：

o   离子强度、pH、温度、氧化还原状态、去垢剂（如Triton X-100）、辅助因子（如精氨酸、蔗糖）及分子伴侣（如谷胱甘肽）。

o   不同缓冲液组合通过调整上述参数，抑制非特异性聚集并促进折叠途径。

·       实验设计：15种缓冲液覆盖13个关键变量（如pH、盐浓度、去垢剂、氧化还原系统），通过统计学分析筛选主要影响因素。

3.       试剂盒组件

·        缓冲液（1-15）：各11 mL，含不同pH（6.0或8.5）、离子强度、辅助因子（如精氨酸、蔗糖）、去垢剂（Triton X-100、PEG 3350）及变性剂（盐酸胍）。

·       氧化还原系统：

o   DTT（用于还原环境）：添加到缓冲液1,3,5,7,9,11,13,15。

• GSH/GSSH（氧化还原对）：添加到缓冲液2,4,6,8,10,12,14，模拟细胞内氧化还原环境。

·        储存条件：DTT溶液4°C保存，GSH/GSSH溶液-20°C保存。

4.       实验流程

1)       任务1：基础缓冲液筛选

a       包涵体处理：

o   纯化包涵体并溶解于8M尿素（含DTT）。

o   调整蛋白浓度至1 mg/mL。

b       复性反应：

o   向15管缓冲液（每管950 μL）中缓慢加入50 μL变性蛋白，轻柔混匀。

o   4°C或22°C孵育1小时，离心分离可溶性与沉淀部分。

c       结果评估：

o   功能活性检测：直接测定蛋白活性（首选）。

o   免疫印迹/SDS-PAGE：分析可溶部分中目标蛋白含量。

o   体积排阻色谱（SEC）：区分正确折叠与聚集蛋白。

d       数据分析：

o   构建表格对比各缓冲液条件的影响因子（pH、盐、去垢剂等）。

o   计算各因子的“相对效应值”（Relative Effect），确定关键参数。

2)       任务2：缓冲液优化

a       条件优化：

o   根据筛选结果，调整关键因素（如pH梯度、盐浓度范围）进行多水平测试。

o   评估高浓度蛋白（>1 mg/mL）下的复性效率。

b      规模化复性：

o   稀释法：适用于小规模（1-20 mg），需后续浓缩。

o   透析/超滤：适用于大规模（>20 mg），逐步去除变性剂。

o   示例：动态透析法（48小时梯度置换缓冲液）。

5.       补充方案

1)       包涵体纯化

步骤：

o   破碎细胞后离心收集包涵体。

o   用含4M尿素、去垢剂的洗涤液去除杂质。

o   溶解于6M盐酸胍或8M尿素（含DTT）。

o   关键点：优化洗涤条件（尿素浓度、去垢剂）以提高纯度。

2)       提高可溶性蛋白产量

o   培养基优化：测试不同培养基（如Turbo Broth™）对蛋白可溶性的影响。

o   分子伴侣共表达：诱导GroEL/GroES等伴侣蛋白，促进正确折叠。

6.       注意事项

n  储存与稳定性：GSH/GSSH需分装避光保存，避免反复冻融。

n  实验验证：复性效率需通过功能活性验证，避免仅依赖SDS-PAGE结果。

n  规模化挑战：高浓度复性需防止聚集，建议结合透析与梯度稀释。

7.       应用与限制

n  适用场景：重组蛋白药物开发、酶学研究、抗体生产。

n  局限性：无法保证所有蛋白成功复性；需结合后续纯化步骤去除杂质。

总结：Theta试剂盒通过系统筛选与优化，为包涵体蛋白复性提供高效解决方案，平衡了实验效率与结果可靠性。用户需结合具体蛋白特性调整条件，并优先通过功能活性验证复性效果。