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包装内容：
产品编号 | 产品名称 | 包装 |
P2009 | Tco-HF DNA Polymerase (1U/μl) | 100U |
B2009 | 10X Tco-HF PCR Buffer | 1ml |
K1002 | dNTP (10mM each) | 150μl |
B1001 | 6X DNA Loading Buffer | 1ml |
产品简介：
来源于热球菌的基因工程聚合酶，高效高保真，错配率~4×10-7，保真度为Taq的450倍；延伸速率2 kb/min。
高稳健性，反应成功率极高，需要优化步骤最少。
适用于高保真PCR、克隆、长片段PCR、复杂模板PCR、制备测序模板、高通量PCR、微阵列、诱变PCR。
高保真DNA聚合酶片段和DNA结合蛋白片段融合重组蛋白。
具有5′-3′DNA聚合酶和3′-5′核酸外切酶活性，产物为平滑末端。
于72℃，30分钟内将10 nmol脱氧核苷酸掺入到酸不溶性物质所需的酶量定义为1个活性单位（U）。
无外源核酸酶活性，无宿主DNA/RNA；蛋白纯度大于99%。
使用说明：
反应体系：解冻并彻底混匀各组分，于冰浴设置如下反应体系。
Component | 50μl reaction | Final Concentration | |
10X Tco-HF PCR Buffer | 5μl | 1X | |
10mM dNTPs | 1μl | 200µM | |
10µM Forward Primer | 2μl | 0.4µM (0.05~1µM) | |
10µM Reverse Primer | 2μl | 0.4µM (0.05~1µM) | |
xμl | Genomic DNA | 0.1–1μg | |
plasmid or viral DNA | 0.1–10ng | ||
cDNA | 1-5μl | ||
Tco-HF DNA Polymerase | 1µl | 1U/50µl PCR | |
Nuclease-free water | Up to 50µl | ||
设置如下热循环程序，开始PCR反应。
Step | Temp. | Time | |
Initial Denaturation | 95°C | 2min | |
30 Cycles | Denaturation | 95°C | 25s |
Annealing | 51-53°C, Tm-5℃ | 30s | |
Extension | 72°C | 1min/kb | |
Final Extension | 72°C | 5min | |
Hold | 4°C | ||
常见问题及建议
1. 严格设置阳性对照和阴性对照。
2. 引物设计
（1） 建议使用专业软件如Oligo或Primer，引物长度20-40碱基，GC含量40-60%，Tm值接近。
（2） 避免形成引物自身或引物间二聚体。
（3） 避免引物3’端连续的G或者C导致非特异性扩增。
3. 产物少或无产物
（1） 使用新鲜的高质量dNTP。
（2） 酶失活或未加入酶，适当增加酶的用量。
（3） 模板含有杂质，改善纯化方法；增加模板量。
（4） 增加延伸时间。
（5） 退火温度不佳，建议使用专业工具计算或者进行梯度退火PCR优化。
（6） 引物设计不佳，需要考虑GC含量、二级结构、二聚体、退火温度、长度、特异性等因素重新设计合成引物。
（7） 反应条件欠佳，适当优化Mg2+浓度，增加循环数。
（8） 对多数模板而言最佳变性温度为98℃或更高。
4. 非特异性扩增/产物弥散
（1） 提高退火温度。
（2） 缩短延伸时间。
（3） 减少酶的用量。
（4） 优化Mg2+浓度。
（5） 引物浓度高，特异性差。重新设计合成或降低引物终浓度。
（6） 减少循环次数。
（7） 适当调整模板量过多。
（8） 外源DNA污染，建议重新纯化。
