M-MLV Reverse Transcriptase RNase H-, deletion

制备长片段cDNA和高含量全长cDNA文库

*若您需要这支酶的表达载体和菌株，可以联系我们。

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制备长片段cDNA和高含量全长cDNA文库

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包装内容：

产品编号	产品名称	包装
P2021	M-MLV Reverse Transcriptase RNase H-, deletion (200U/μl)	10KU
K1002	dNTP (10mM each)	100μl
P2058	RNase Inhibitor	30μl
B2021	5X M-MLV Reverse Transcription Buffer	250μl

产品简介：

来源于莫洛尼（氏）鼠白血病病毒，RNA依赖的DNA聚合酶。经基因改造消除RNase H活性结构域，热稳定性更高，从而使全长cDNA 产量更高。可用于长mRNA（>5kb）为模板的cDNA合成。

与野生型相比，这一突变体有助于制备长片段cDNA和高含量全长cDNA文库。

在37℃、10分钟内催化完成1nmole dNTP掺入到酸不溶性物质所需要的酶量定义为1个活性单位。

无外源核酸酶活性，无宿主DNA/RNA。

使用说明：

反应体系

Component	20μl reaction	Final Concentration
Template RNA	Total RNA	1ng-5μg
	mRNA/poly(A) RNA	1-500ng
	specific RNA	1pg-500ng

Primer	Oligo(dT)_12-18	0.5μg
	Random Hexamer	50-250ng
	Gene-specific	2pmole

Nuclease-free water	Up to 13.5µl
轻轻混匀后短暂离心，65℃孵育5分钟，立即置于冰上冷却，加入如下组分。
5X M-MLV Reverse Transcription Buffer	4μl	1X


RNase Inhibitor (40U/μl)	0.5μl	1U/μl
dNTP Mix (10mM each)	1μl	0.5mM
轻轻混匀后短暂离心。如果使用Oligo(dT)_12-18或基因特异性引物，42ºC孵育2分钟。如果使用随机引物，先在25ºC孵育2分钟。加入反转录酶。
M-MLV Reverse Transcriptase RNase H-, deletion	1μl	200U

轻轻混匀后短暂离心。42℃孵育50分钟，70℃失活15分钟终止反转录反应。如果使用随机引物，先在25ºC孵育10分钟，然后42℃孵育50分钟，70℃失活15分钟终止反转录反应。

反转录产物PCR扩增没有特异性条带的可能原因与建议：

1. 建议使用内参基因做对照。

2. RNA模板降解，可以通过琼脂糖凝胶电泳分析总RNA质量。严格遵守RNA操作要求避免发生降解。

3. RNA纯度低，存在抑制反转录反应残余成分，建议使用Trizol或柱纯化。

4. RNA模板量不足，建议更换模板来源或DNase I去除DNA干扰。

5. 对于长片段cDNA反转录不建议使用热失活方法终止反应，可能会导致产物断裂。此时可以考虑酚氯仿抽提或柱纯化方法。

6. 对于复杂模板如高GC含量或二级结构，可以适当提高反应温度至45-50℃。

7. 某些情况可能需要去除cDNA互补RNA，可以加1ul (2U) RNase H在37℃孵育20分钟。