Pfusion-HF DNA Polymerase

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包装内容：

产品简介：

高效高保真的DNA聚合酶，错配率~2×10^-6，保真度为Taq的50倍；延伸速率2~4 kb/min。

高稳健性，反应成功率极高，需要优化步骤最少。

适用于高保真PCR、克隆、长片段PCR、复杂模板PCR、制备测序模板、高通量PCR、微阵列、诱变PCR。

高保真DNA聚合酶片段和DNA结合蛋白片段融合重组蛋白。

具有5′-3′DNA聚合酶和3′-5′核酸外切酶活性，产物为平滑末端。

于74℃，30分钟内将10 nmol脱氧核苷酸掺入到酸不溶性物质所需的酶量定义为1个活性单位（U）。

无外源核酸酶活性，无宿主DNA/RNA；蛋白纯度大于99%。

使用说明：

反应体系：解冻并彻底混匀各组分，于冰浴设置如下反应体系。

设置如下热循环程序，开始PCR反应。

*T_m值计算工具参考www.thermofisher.com/tmcalculator

引物长度>20nt，T_m≥69°C或者引物长度≤20nt，T_m≥72°C考虑两步法扩增。

常见问题及建议

1.      严格设置阳性对照和阴性对照。

2.      引物设计

（1）    建议使用专业软件如Oligo或Primer，引物长度20-40碱基，GC含量40-60%，T_m值接近。

（2）    避免形成引物自身或引物间二聚体。

（3）    避免引物3’端连续的G或者C导致非特异性扩增。

（4）    注意rPhusion退火温度较高，可参考线上工具https://tmcalculator.neb.com/#!/main或www.thermofisher.com/tmcalculator计算。

3.      产物少或无产物

（1）    使用新鲜的高质量dNTP。

（2）    酶失活或未加入酶，适当增加酶的用量。

（3）    模板含有杂质，改善纯化方法；增加模板量。

（4）    增加延伸时间。

（5）    退火温度不佳，建议使用专业工具计算或者进行梯度退火PCR优化。

（6）    引物设计不佳，需要考虑GC含量、二级结构、二聚体、退火温度、长度、特异性等因素重新设计合成引物。

（7）    反应条件欠佳，适当优化Mg²⁺浓度，增加循环数。

（8）    对多数模板而言最佳变性温度为98℃或更高。

4.      非特异性扩增/产物弥散

（1）    提高退火温度。

（2）    缩短延伸时间。

（3）    减少酶的用量。

（4）    优化Mg²⁺浓度。

（5）    引物浓度高，特异性差。重新设计合成或降低引物终浓度。

（6）    减少循环次数。

（7）    适当调整模板量过多。

（8）    外源DNA污染，建议重新纯化。