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Tth DNA Polymerase

Tth DNA Polymerase

热稳定性DNA聚合酶，具有反转录酶活性

*若您需要这支酶的表达载体和菌株，可以联系我们。

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热稳定性DNA聚合酶，具有反转录酶活性

*若您需要这支酶的表达载体和菌株，可以联系我们。

-20℃储存，<0℃运输。

 

包装内容：

产品编号

产品名称

包装

P2023

Tth DNA Polymerase (5U/μl)

500U

B20231

10X Tth PCR Buffer

1ml

B20232

5X Tth RT-PCR Buffer, One-Step

0.75ml

B20233

10X Tth Reverse Transcription Buffer

0.3ml

K1002

dNTP (10mM each)

200μl

B1001

6X DNA Loading Buffer

0.5ml

K1008

Mn(OAc)2 solution (25mM)

0.75ml

K1009

MnCl2 (9mM)

0.3ml

K1010

EGTA (7.5mM)

1ml

 

 

产品简介：

来源于嗜热真细菌Thermus thermophilus HB8的热稳定性DNA聚合酶，具有内在的反转录酶活性，能用于一步法检测。

高持续合成能力和耐热性。

5′-3′DNA聚合酶活性，无3′-5′外切酶活性。无RNase H酶活。

可用于DNA片段扩增/标记，Mn2+依赖的反转录cDNA合成，real-time PCR，细胞病毒RNA定量分析。

反转录温度60-70℃，特异性更高。对PCR抑制物具有更高的耐受性。

可RT-PCR扩增1kb产物。

于70℃，30分钟内将10 nmol脱氧核苷酸掺入到酸不溶性物质所需的酶量定义为1个活性单位（U）。

无外源核酸酶活性，无宿主DNA/RNA；蛋白纯度大于99%。

 

 

使用说明：

1.        一步法RT-PCR反应体系：解冻并彻底混匀各组分，于冰浴设置如下反应体系。

Component

50μl reaction

Final   Concentration

5X Tth RT-PCR Buffer, One-Step

5μl

1X

10mM dNTPs

1.5μl

300µM each

10µM Forward Primer

2.5μl

0.5µM (0.2~1µM)

10µM Reverse Primer

2.5μl

0.5µM (0.2~1µM)

Template RNA

xμl

Up to 1μg

Mn(OAc)2, 25mM

5μl

2.5mM

Tth DNA Polymerase

1µl

5U

Nuclease-free water

Up to 50µl


轻轻混匀后短暂离心，设置如下热循环程序，开始PCR反应。

Step

Temp.

Time

RT Reaction

60-70℃

30min




Initial Denaturation

94°C

1min

10 Cycles

Denaturation

94°C

30s

Annealing

50-70°C  

30s

Extension

72°C

45s





20-30 Cycles

Denaturation

94°C

30s

Annealing

50-70°C  

30s

Extension

72°C

45s, add to

each cycle   5sec





Final Extension

72°C

7min

Hold

4-10°C


2.        两步法RT-PCR反应体系：解冻并彻底混匀各组分，于冰浴设置如下反应体系。

Component

20μl reaction

Final   Concentration

10X Tth Reverse Transcription Buffer

2μl

1X

10mM dNTPs

0.4μl

200µM each

MnCl2 (9mM)

2μl

0.9mM

10µM Reverse Primer

1.5μl

0.75µM

Template RNA

xμl

Up to 200ng

Mn(OAc)2, 25mM

5μl

2.5mM

Tth DNA Polymerase

0.8µl

4U

Nuclease-free water

Up to 20µl


轻轻混匀后短暂离心，60-70ºC孵育10-30分钟。Tth DNA Polymerase最佳反应温度为70ºC，但是可能会导致部分RNA模板降解。加入如下混合物。

Component

80μl reaction

Final Concentration

10X Tth PCR Buffer

8μl

0.8X

EGTA, 7.5mM

0.4μl

200µM each

10µM Forward Primer

1.5μl

150nM

Nuclease-free water

Up to 80µl


轻轻混匀后短暂离心，设置如下热循环程序，开始PCR反应。

Step

Temp.

Time

Initial   Denaturation

94°C

1min

10 Cycles

Denaturation

94°C

30s

Annealing

50-70°C

30s

Extension

72°C

45s





20-30 Cycles

Denaturation

94°C

30s

Annealing

50-70°C

30s

Extension

72°C

45s, add to

each cycle 5sec





Final   Extension

72°C

7min

Hold

4-10°C


3.        PCR反应体系：解冻并彻底混匀各组分，于冰浴设置如下反应体系。

Component

50μl reaction

Final Concentration

10X Tth PCR Buffer

5μl

1X

10mM dNTPs

1μl

200µM each

10µM Forward Primer

2μl

400nM

10µM Reverse Primer

2μl

400nM

Template DNA

xμl

Up to 500ng

Tth DNA Polymerase

0.5µl

2.5U

Nuclease-free water

Up to 50µl


轻轻混匀后短暂离心，设置如下热循环程序，开始PCR反应。

Step

Temp.

Time

Initial Denaturation

94°C

1min

10 Cycles

Denaturation

94°C

30s

Annealing

50-70°C

30s

Extension

72°C

45s





20-30 Cycles

Denaturation

94°C

30s

Annealing

50-70°C

30s

Extension

72°C

45s, add to

each cycle 5sec





Final   Extension

72°C

7min

Hold

4-10°C


使用高纯度模板RNA（不超过1μg总RNA），推荐使用Trizol或者柱纯化试剂盒。

严格遵守RNA操作规程，避免发生核酸酶污染。

优化Mn2+浓度1-4mM，取决于所使用的引物。