2X Pwo PreMix

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包装内容：

产品简介：

Pwo DNA Polymerase是最常用的高保真聚合酶，适用于高保真PCR，点突变PCR，克隆，基因表达。

延伸速率1 kb/min，错配率~5×10^-6，保真度为Taq的18倍

来源于嗜热菌Pyrococcus woesei，极度热稳定，+100°C半衰期大于2小时。

具有5′-3′DNA聚合酶和3′-5′核酸外切酶活性，无5′-3′外切酶活性。产物为平滑末端。

于70℃，30分钟内将10 nmol脱氧核苷酸掺入到酸不溶性物质所需的酶量定义为1个活性单位（U）。

无外源核酸酶活性，无宿主DNA/RNA；蛋白纯度大于99%。

使用说明：

反应体系：解冻并彻底混匀各组分，于冰浴设置如下反应体系。

设置如下热循环程序，开始PCR反应。

常见问题及建议

1.      严格设置阳性对照和阴性对照。

2.      引物设计

（1）    建议使用专业软件如Oligo或Primer，引物长度20-35碱基，GC含量40-60%，T_m值接近。

（2）    避免形成引物自身或引物间二聚体。

（3）    避免引物3’端连续3个及以上G或者C导致非特异性扩增。

3.      产物少/无产物

（1）    酶失活或未加入酶，适当增加酶的用量。

（2）    纯化模板，调整模板量。

（3）    退火温度不佳，建议进行梯度退火PCR优化。

（4）    优化引物浓度， 0.2-0.5μM。

（5）    引物设计不佳，需要考虑GC含量、二级结构、二聚体、退火温度、长度、特异性等因素重新设计合成引物。

（6）    优化反应条件，包括Mg²⁺浓度和循环数。

4.      非特异性扩增

（1）    引物浓度高，特异性差。重新设计合成或降低引物终浓度。

（2）    循环的次数过多。适当增加模板量，减少循环次数。

（3）    酶的用量偏高或酶的质量不好，降低酶量或使用高质量的聚合酶。

（4）    退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间。

（5）    模板量过多，适当调整。

（6）    外源DNA污染，建议重新纯化。