感受态细胞名称：Rosetta-gami B(DE3)pLysS Competent Cells；Rosetta-gami B(DE3)pLysS感受态细胞

菌种类型：E.coli

培养基： LB培养基

产品规格：10×100μl

转化效率：1~5 × 10⁶ cfu/µg pUC19

基因型：F^– ompT hsdS_B (r_B^– m_B^–) gal dcm lacY1 ahpC (DE3) gor522::Tn10 trxB pLysSRARE (Cam^R, Kan^R, Tet^R)

抗性：氯霉素，卡那霉素，四环素

转化条件：42 ℃热激

培养条件：37 ℃,  有氧

用途：蛋白表达

储存条件：-80 ℃保存，干冰运输

特点和简介

n  聚合了BL21，Tuner，Origami和 Rosetta四种菌株的优点；

n  细胞质Lon蛋白酶和和胞外膜上OmpT蛋白酶缺陷，有效减少目的蛋白降解；

n  lacY1基因 (半乳糖苷透性酶基因)突变赋予其Tuner菌株的优点——IPTG以均一速度进入体系中大肠杆菌的每个细胞，产生更加严格、均一的浓度依赖；

n  Origami菌株包括突变的硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase) (trxB)和谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase) (gor)基因，有利于高效形成正确折叠的含有二硫键的蛋白，增强蛋白的可溶性；

n  Rosetta(DE3)菌株具有氯霉素抗性，补充大肠杆菌缺乏的6种稀有密码子(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA)对应的tRNA，提高外源基因，尤其是真核基因在原核系统中的表达水平；

n  λ噬菌体DE3溶原化衍生菌株，IPTG可以诱导在lacUV5启动子控制噬菌体T7 RNA聚合酶表达；

n  适合IPTG诱导的T7启动子载体，常用的pET系列载体；

n  携带pLysS质粒，具有氯霉素抗性，可以表达能降解T7 RNA聚合酶的T7溶菌酶，从而抑制T7 RNA聚合酶及目的蛋白本底表达；

n  Rosetta-gami B(DE3)pLysS感受态细胞能够用于氨苄抗性和壮观霉素抗性质粒的原核表达。

简化转化步骤

1.         取Rosetta-gami B(DE3)pLysS感受态细胞置于冰浴融化。

2.         加入质粒DNA (1~100 ng），轻弹混匀，冰浴静置30分钟。

3.         42 ℃水浴热激45秒，快速转移至冰浴静置冷却3分钟。

4.         加入无抗培养基（SOC或LB），混匀后37 ℃，225rpm摇床振荡培养45分钟。

5.         取100μl培养物均匀涂布至对应抗性的琼脂培养板。37 ℃倒置培养12-16小时。

注意：如果必要可以离心（4000 rpm，3分钟）收集所有菌体，吹打悬浮后涂布平板。

注意事项

1.         -80 ℃保存，避免反复冻融和放置时间过长。

2.         感受态细胞最好在冰中缓慢融化，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率。进行转化操作时，应根据相应的温度及无菌条件的要求进行。转化物的体积不能超过感受态细胞体积的1/10。

3.         混入质粒时应轻柔操作。

4.         最佳诱导时间，温度，IPTG浓度需实验优化。

5.         除复苏培养基为无抗生素外，其余所用培养基、培养液均应含有相应抗生素，以防质粒丢失。

6.         不能用于具有卡那霉素抗性质粒的表达。